Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 16Autori He Y, Hu C, Liu S, Xu M, Liang G, Du D, Liu T, Cai F, Chen Z, Tan Q, Deng L, Xia QPubblicato il 2 agosto 2022 Volume 2022:16 Pagine 2479—2495DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S364352Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Tuo DengYanqiu He,1,* Cheng Hu,1,* Shiyu Liu,1 Mingjie Xu,1 Ge Liang,2 Dan Du,3 Tingting Liu,1 Fei Cai,1 Zhiyao Chen,1 Qingyuan Tan,1 Lihui Deng,1 Qing Xia1 1Centro Pancreatite, Dipartimento e Laboratorio di Medicina Integrata Cinese Tradizionale e Occidentale, Ospedale della Cina Occidentale, Università di Sichuan, Chengdu, Repubblica Popolare Cinese;2Laboratorio di proteomica clinica e metabolomica, Istituti di genetica dei sistemi, Centro scientifico di frontiera per le reti molecolari legate alle malattie, Ospedale della Cina occidentale, Università di Sichuan, Chengdu, Repubblica popolare cinese;3Advanced Mass Spectrometry Center, Research Core Facility, Frontiers Science Center for Disease-Related Molecular Network, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Repubblica popolare cinese *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Corrispondenza: Lihui Deng, Pancreatite Center, Department and Laboratorio di medicina tradizionale cinese e occidentale integrata, Ospedale della Cina occidentale, Università di Sichuan, Chengdu, Repubblica popolare cinese, e-mail [protetto da e-mail] Contesto: la pancreatite acuta (AP) è una malattia infiammatoria del pancreas esocrino senza un trattamento specifico.È stato segnalato che l'iniezione di Shenmai (SMI) elimina la gravità dell'AP sperimentale.Questo studio mirava a esplorare i meccanismi alla base degli effetti protettivi sinergici di SMI su AP sulla base della farmacologia di rete e della convalida sperimentale.Metodi: sono state eseguite analisi farmacologiche di rete e docking molecolare basati su componenti identificati per costruire potenziali bersagli e percorsi terapeutici.I componenti principali dell'SMI sono stati rilevati tramite cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata con spettrometria di massa a tempo di volo quadrupolare (UHPLC-QTOF/MS).L'effetto dell'SMI e dei componenti identificati sul danno cellulare e sulla segnalazione di IL6/STAT3 è stato valutato sulle cellule 266-6 della linea cellulare acinosa del pancreas di topo.Infine, il taurocolato di sodio al 4% (NaT) è stato utilizzato per indurre il modello AP per valutare gli effetti dell'SMI nel trattamento dell'AP e convalidare i potenziali meccanismi molecolari.Risultati: Cercando nei database TCMSP ed ETCM, sono stati ottenuti 119 componenti candidati di SMI.L'analisi UHPLC-QTOF/MS ha determinato con successo i componenti rappresentativi dell'SMI: ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re e ophiopogonin D. Sono stati ottenuti quindici target hub e otto percorsi correlati per stabilire la rete farmacologica principale.L'analisi della sottorete e l'aggancio molecolare hanno indicato che gli effetti di questi quattro componenti SMI principali erano principalmente correlati al percorso dell'interleuchina (IL) 6/STAT3.In vitro, SMI, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re e ophiopogonin D hanno aumentato la vitalità cellulare delle cellule acinose pancreatiche 266-6 del topo stimolate con NaT e diminuito l'espressione di IL6 e STAT3.In vivo, 10 ml/kg di SMI hanno alleviato significativamente i cambiamenti istopatologici del pancreas e l'espressione di IL6 e STAT3 nei topi AP.Conclusione: questo studio ha dimostrato che l'SMI può esercitare effetti antinfiammatori contro AP sopprimendo l'attivazione di IL6/STAT3, fornendo così una base per il suo potenziale utilizzo nella pratica clinica e ulteriori studi nel trattamento dell'AP.Parole chiave: pancreatite acuta, iniezione di Shenmai, farmacologia di rete, docking molecolare, via di segnalazione IL6/STAT3La pancreatite acuta (AP) è una delle malattie gastrointestinali più comuni, con un costo stimato di circa 2,6 miliardi di dollari all'anno e l'incidenza globale è ancora in aumento.1,2Gli eventi intra-acinosi che portano alla cascata infiammatoria amplificano la sindrome da risposta infiammatoria sistemica e alla fine portano a sindromi da disfunzione d'organo multipla e alla morte.L'AP grave è caratterizzata da un'insufficienza d'organo persistente con un tasso di mortalità sostanziale del 36-50% e causa di una ridotta qualità della vita e di un significativo onere socioeconomico.3-5 Recente meta-analisi di rete che ha incluso 7366 partecipanti in 78 studi randomizzati e controllati per valutare gli effetti degli interventi farmacologici su AP non hanno riscontrato benefici clinici coerenti da alcun intervento.6 Le attuali linee guida raccomandano metodi di routine per la gestione di AP.7,8La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata applicata clinicamente per migliaia di anni in Cina e ha dimostrato di essere efficace e sicura per il trattamento dell'AP nella pratica clinica.9 Il meccanismo alla base della MTC nel trattamento dell'AP rimane poco chiaro.Basato sulla teoria della MTC, l'AP è innescato dall'invasione di "calore-male" agli organi.Abbiamo proposto i principi terapeutici che richiedono "nutrire Qi e Yin, rimuovere la stasi del sangue, eliminare il calore, rimuovere le tossine e purificare" (abbreviati come metodi "Yi-Huo-Qing-Xia") per AP.10-12, gli studi hanno studiato trattamenti che implicano "l'eliminazione del calore, la rimozione delle tossine e la purificazione", che includono prescrizioni per il decotto di dachengqi, il decotto di chaiqinchengqi e il decotto di qingyi. nella carenza di qi-yin.Pertanto, nutrire Qi e Yin è importante per il trattamento dell'AP.Tuttavia, pochi studi si sono concentrati sul nutrimento di Qi e Yin nelle prime fasi di AP.Shenmai injection (SMI), una formula derivata dalla prescrizione Shendong yin,21 è un prodotto sterile estratto e purificato da materiali medicinali cinesi sotto la guida della teoria della MTC e delle moderne tecnologie di produzione farmaceutica.È una delle formule principali per nutrire Qi e Yin.22,23 SMI è indicato come trattamento adiuvante per shock, malattie coronariche e malattie cardiache polmonari croniche ed è raccomandato dalla Commissione sanitaria nazionale cinese per malattie gravi o critiche da coronavirus (COVID-19) (2020).24 Uno studio precedente ha mostrato che l'SMI ha ridotto la gravità dell'AP sperimentale.25 Tuttavia, i singoli componenti responsabili delle varie risposte farmacologiche ei potenziali meccanismi dell'SMI sull'AP rimangono poco chiari.Qui, abbiamo studiato il possibile ruolo antinfiammatorio e i meccanismi dell'SMI nel trattamento dell'AP integrando la farmacologia di rete, l'analisi dell'aggancio molecolare e la convalida sperimentale.La Figura 1 presenta un diagramma di flusso del disegno dello studio.Figura 1 Diagramma di flusso dello studio.Tutti i componenti di Panax ginseng e Radix Ophiopogonis sono stati determinati dal database farmacologico e dalla piattaforma di analisi dei sistemi di medicina tradizionale cinese (TCMSP; https://tcmspw.com/) e dall'Enciclopedia della medicina tradizionale cinese (ETCM; http://www.tcmip .cn/ETCM/index.php/Home/Indice).Sulla base dei componenti attivi precedentemente selezionati e dei principali componenti farmacologicamente attivi riportati,26,27 abbiamo eseguito l'analisi UHPLC-QTOF/MS per verificare che i componenti identificati predominanti di SMI fossero disponibili nel campione utilizzato per esperimenti successivi.SMI è un farmaco brevettato cinese estratto da Panax ginseng (Panax ginseng CA Mey, cotto a vapore e secco) e Ophiopogon japonicus (Ophiopogon japonicus [Lf] Ker-Gawl, radice).SMI è stato prodotto da Sichuan Chuanda West China Pharmaceutical Co., Ltd. (Chengdu, Cina) e acquistato dalla farmacia ambulatoriale del West China Hospital.Gli standard di radice di Panax ginseng e Ophiopogon sono stati acquistati da Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Cina) e mantenuti a 25 ℃.La tabella 1 fornisce le informazioni dettagliate sul materiale medica di SMI.La tabella supplementare 1 fornisce le informazioni dettagliate sui reagenti e sugli standard dei composti naturali.Tabella 1 Informazioni di base di due materiali medicinali di SMITabella 1 Informazioni di base di due materiali medicinali di SMIL'SMI è stato centrifugato a 13.000 giri/min per 3 minuti e sono stati prelevati 10 μL di surnatante per il test.Gli standard sono stati disciolti in metanolo e ottenuti come una soluzione da 1 μg/mL.L'SMI e gli standard sono stati analizzati su un UHPLC (Nexera LC-30A, Shimadzu Corporation, Kyoto, Giappone) con uno strumento Q-TOF MASS (X500R, AB SCIEXTM).La separazione è stata eseguita su una colonna BEH C18 (100×2,1 mm, 3 µm, acque) a 40℃ con una portata di 0,5 mL/min.La fase mobile era costituita da acqua contenente lo 0,1% di acido formico e acetonitrile ed è stata eseguita con il seguente programma di eluizione a gradiente: 0 min, 90% A, 10% B;6 minuti, 5% A, 95% B;8 minuti, 5% A, 95% B;8,1 minuti, 90% A, 10% B;10 min, 90% A, 10% B. Il volume di iniezione era di 10 μL.Il sistema Q-TOF-MS è stato utilizzato utilizzando una sorgente di ionizzazione elettrospray in modalità negativa con i seguenti parametri operativi: sorgente ionica gas1 (gas 1): 50, sorgente ionica gas2 (gas 2): 50, curtain gas: 35, temperatura sorgente : 500 ℃, tensione dello spray ionico fluttuante: 4500 V, intervallo di scansione TOF MS: 200–1200 Da, intervallo di scansione ionica del prodotto: 50–1200 Da, tempo di accumulo della scansione TOF MS 0,2 s e tempo di accumulo della scansione ionica del prodotto: 0,01 s.Lo spettro di massa secondario è stato acquisito mediante acquisizione dipendente dalle informazioni, in modalità ad alta sensibilità, con potenziale di declustering: ±60 V ed energia di collisione: 35±15e V. Tutti i dati sono stati elaborati utilizzando SCIEX OS-MQ 2.1 (AB SCIEX™).I formati canonici della struttura SMILES dei composti sono stati ottenuti dal database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) e gli obiettivi dei composti sono stati identificati inserendoli nel database Swiss Target Prediction (http:/ /www.swisstargetprediction.ch/) con le specie limitate a “Homo sapiens” e “probabilità >0”.I target associati ad AP sono stati identificati utilizzando "pancreatite acuta" come parola chiave in OMIM (https://www.omim.org/), DisGeNet (http://www.disgenet.org), HPO (https://hpo .jax.org/app/) e NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).I nomi delle proteine ​​di tutti i target sono stati convertiti in simboli genetici ufficiali utilizzando UniProt (https://www.uniprot.org/).Dopo aver rimosso i geni duplicati, i potenziali bersagli terapeutici di SMI sono stati raccolti e ulteriormente visualizzati nel database Evenn (//www.ehbio.com/test/venn/#/).La rete PPI dei potenziali bersagli terapeutici è stata costruita e analizzata utilizzando il database STRING (https://string-db.org/) con le specie limitate a "Homo sapiens" e un punteggio di confidenza >0,7.I risultati sono stati salvati come file TSV e ulteriormente visualizzati in Cytoscape 3.7.2.Nella rete PPI, obiettivi con gradi elevati hanno svolto un ruolo fondamentale nella correlazione centrale.Abbiamo considerato i target con valori di grado maggiori della mediana come target principali.Il database DAVID 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/) è stato utilizzato per eseguire l'annotazione GO e l'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG dei potenziali bersagli terapeutici.I risultati sono stati visualizzati utilizzando la piattaforma bioinformatica (http://www.ehbio.com/ImageGP/).Dai principali bersagli ottenuti in precedenza e dai percorsi arricchiti, abbiamo costruito la rete composti-bersagli-percorsi come rete farmacologica principale.La via dell'interleuchina (IL) 6/STAT3 è stata selezionata dall'analisi della rete PPI e dalle vie di segnalazione KEGG.Una sottorete di percorsi-bersagli-composti IL6/STAT3 è stata estratta dalla rete principale.L'aggancio molecolare è stato eseguito per studiare visivamente le interazioni tra i principali componenti identificati e i potenziali bersagli selezionati utilizzando AutoDock Vina 1.1.2.In primo luogo, le strutture bidimensionali dei componenti sono state ottenute dal database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov), quindi convertite in strutture tridimensionali in formato mol2 dal software ChemOffice per preparare i composti leganti della micromolecola .I componenti e le principali proteine ​​target per l'aggancio sono stati preparati utilizzando il software PyMOL 1.7.2.1 e salvati come file PDBQT.AutoDock Vina (//vina.scrip ps.edu/) è stato utilizzato per eseguire l'aggancio molecolare e calcolare l'affinità di legame.I risultati dell'aggancio per i componenti attivi e i principali bersagli proteici sono stati visualizzati con il software PyMOL.Il taurocolato di sodio (NaT) proveniva da Sigma-Aldrich (#86339-5G, St. Louis, MO, USA).I seguenti anticorpi sono stati utilizzati per il Western blotting: fosfo-STAT3 (Tyr705, n. 9145S), STAT3 (n. 12640S), anti-IL6 (n. 12912S) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA);l'anti-β-actina (#66009-1-lg) proveniva da Proteintech (Wuhan, Hubei, Cina).Il cocktail completo di inibitore della proteasi (#05892791001) e il cocktail di inibitore della fosfatasi (#04906845001) provenivano da Roche (Mannheim, Germania).Il kit di analisi delle proteine ​​​​dell'acido bicinconinico (n. 23225) proveniva da Thermo Fisher (Rockford, Illinois, USA).Le membrane di polivinilidene difluoruro (# IPVH00010) e il reagente di rilevamento Western Blotting Ultra ECL (# 4AW011) provenivano da 4A Biotech (Beijing 4A Biotech Co., Ltd).TRIzol Reagent (#15596026) proveniva da Life Technologies (Waltham, MA, USA).Gli standard chimici per i componenti contenuti SMI sono stati acquistati da Sichuan Push Bio-technology Co., Ltd. (Chengdu, Sichuan, Cina).Per determinare se l'SMI ha un effetto protettivo sulle cellule, abbiamo eseguito test di vitalità cellulare.Il kit di conteggio cellulare-8 (CCK-8) è stato utilizzato per indicare il numero di cellule vitali nei test di proliferazione e citotossicità.La linea cellulare acinosa pancreatica di topo 266–6 (CRL-2151, ATCC, Manassas, VA, USA) è stata coltivata nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 ℃ con il 5% di CO2.Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti alla stessa densità, pretrattate con SMI (1, 5, 10 o 20 μL/mL) per 24 ore, quindi incubate in un mezzo contenente NaT (5 mM) per 3 ore.Il test CCK-8 è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore.Le cellule e i tessuti pancreatici sono stati omogeneizzati in tampone RIPA contenente 50 mmol/L di Tris (pH 7,4), 150 mmol/L di NaCl, 1% di desossicolato di sodio, 1% di Triton X-100, 0,1% di SDS, ortovanadato di sodio, fluoruro di sodio, EDTA, leupeptina e un mix di inibitori della proteasi e della fosfatasi.Gli estratti proteici sono stati risolti mediante elettroforesi su gel SDS-PAGE e trasferiti su membrane di polivinilidene difluoruro.Quindi le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% o BSA al 5% per 1 ora a temperatura ambiente, seguita da incubazione con anticorpi primari durante la notte a 4°C e incubazione con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente.Le bande immuno-reattive sono state visualizzate dal sistema di rilevamento chemiluminescente (Bio-Rad; Hercules, CA, USA).Per stimare i livelli di proteine, i valori di densità ottica in ciascuna macchia sono stati espressi rispetto a quelli del controllo di carico (β-actina).I topi maschi C57BL/6J (del peso di 22–25 g) sono stati acquistati da Gempharmatech Co., Ltd. (Nanchino, Cina), mantenuti a 22 ± 2 ℃ con un ciclo luce-buio di 12 ore e alimentati con cibo standard di laboratorio e acqua in tutto l'esperimento.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate dal Comitato etico animale del West China Hospital, Università di Sichuan (2021333A).I topi sono stati divisi rispettivamente in gruppo di controllo, AP e AP+SMI (n = 8 in ciascun gruppo).I topi modello AP sono stati indotti tramite iniezione duttale pancreatica retrograda con taurocolato di sodio al 4% (NaT) disciolto in soluzione fisiologica.In breve, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano al 2% (flusso di gas: 0,5 L/min) utilizzando un vaporizzatore e un sistema di scavenger di gas.Utilizzando tecniche sterili, è stata praticata una piccola incisione laparotomica sulla linea mediana.Il duodeno è stato capovolto per rivelare il suo lato distale e tenuto in posizione da legature.È stato identificato il dotto biliare ed è stato inserito un ago calibro 30 attraverso l'aspetto antimenterico del duodeno per incannulare il dotto biliopancreatico.NaT è stato infuso a 5 μL/min per 10 minuti utilizzando una pompa di perfusione (Pump33DDS, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA).I topi infusi di soluzione salina servivano da controlli.Nel gruppo AP+SMI, SMI (10 ml/kg) è stata iniettata per via intraperitoneale due volte: pretrattata entro 24 h prima dell'induzione di NaT e 1 h dopo la procedura.Gli animali sono stati sottoposti a eutanasia 24 ore dopo l'induzione di NaT e gli organi rilevanti sono stati prelevati per valutarne la gravità.I protocolli dettagliati per la valutazione istopatologica del pancreas sono stati descritti in precedenza.I dati sono stati analizzati utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza e il test post-hoc di Tukey per confronti multipli con il software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).I dati sono presentati come media ± errore standard della media.Un p <0,05 bilaterale è stato considerato statisticamente significativo.Cercando nei database TCMSP ed ETCM, sono stati ottenuti 119 componenti candidati di SMI (Tabella Supplementare 2).Abbiamo quindi utilizzato UHPLC-QTOF/MS per determinare i cinque componenti attivi riportati di SMI con standard chimici facendo corrispondere la massa accurata (m/z, ± 10 ppm), il tempo di ritenzione (± 30 s) e gli spettri MS/MS per un identificazione di livello 1 come mostrato nella Tabella 2.28 L'SMI e il cromatogramma ionico totale (TIC) di standard misti sono mostrati nella Figura 2A.Inoltre, il cromatogramma ionico estratto (EIC) di quattro componenti è presentato nella Figura 1 supplementare. Infine, i profili di frammentazione spettrale MS/MS misurati di SMI e standard sono stati abbinati in base alle loro masse accurate (Figura 2B).Tabella 2 Cromatografia e spettro di massa per componenti e corrispondenti standard autenticiFigura 2 Conferma dei componenti di SMI da composti standard.(A) Cromatogrammi di intensità di picco di base rappresentativi degli standard (linea rossa) e SMI (linea blu).(B) Profili di frammentazione spettrale MS/MS misurati di SMI (in alto, in nero) corrispondenti agli standard chimici (in basso, in rosso).Tabella 2 Cromatografia e spettro di massa per componenti e corrispondenti standard autenticiFigura 2 Conferma dei componenti di SMI da composti standard.(A) Cromatogrammi di intensità di picco di base rappresentativi degli standard (linea rossa) e SMI (linea blu).(B) Profili di frammentazione spettrale MS/MS misurati di SMI (in alto, in nero) corrispondenti agli standard chimici (in basso, in rosso).Utilizzando le condizioni di screening predefinite, abbiamo ottenuto 770 target correlati ai composti candidati e 610 target correlati all'AP (Tabella Supplementare 3).L'analisi PPI ha prodotto 59 potenziali bersagli terapeutici di SMI per il trattamento di AP (Figura 3A).Il database STRING ha rivelato le intersezioni tra questi potenziali bersagli terapeutici con un punteggio di interazione minimo richiesto di 0,7 (alta confidenza).La rete PPI comprendeva 49 nodi e 148 bordi con un punteggio medio del grado di nodo di 6,04 (Figura 3B).Figura 3 Diafonia tra obiettivi SMI e AP.(A) Diagramma di Venn delle interazioni target correlate al composto che si sovrappongono a target AP correlati.(B) Rete di interazione proteina-proteina nel database STRING.Abbreviazioni: SMI, Shenmai injection;AP, pancreatite acuta.Figura 3 Diafonia tra obiettivi SMI e AP.(A) Diagramma di Venn delle interazioni target correlate al composto che si sovrappongono a target AP correlati.(B) Rete di interazione proteina-proteina nel database STRING.Abbreviazioni: SMI, Shenmai injection;AP, pancreatite acuta.Per ottenere obiettivi più cruciali, abbiamo calcolato la centralità intermedia, il percorso più breve e il grado di centralità delle proteine ​​​​bersaglio utilizzando l'analisi topologica.Gli obiettivi con punteggi di laurea superiori al valore medio (6,04) sono stati considerati obiettivi hub.Quindici obiettivi hub sono stati selezionati per ulteriori esplorazioni come obiettivi principali di SMI nel trattamento di AP (Tabella 3, Figura 4A).La Figura 4B fornisce un'analisi visiva dei 15 geni hub tramite CytoHubba, che evidenzia IL6 (gradi = 23) e STAT3 (gradi = 21) come i due principali bersagli di SMI per gli effetti antinfiammatori di AP.L'analisi dell'arricchimento GO ha rivelato che i processi biologici dei geni erano altamente arricchiti per le funzioni apoptotiche e infiammatorie (Figura 4C).Le figure 4D ed E mostrano i componenti cellulari e le funzioni molecolari dei geni.Tabella 3 Geni dell'hub e proprietà topologicaFigura 4 Analisi dell'arricchimento GO.(A) Istogramma dei punteggi del grado del gene hub.(B) Analisi visiva dei geni hub in CytoHubba.(C–E) Analisi dell'arricchimento GO dei geni hub da tre aspetti: processo biologico (BP), componente cellulare (CC) e funzione molecolare (MF).Abbreviazione: GO, Ontologia genica.Tabella 3 Geni dell'hub e proprietà topologicaFigura 4 Analisi dell'arricchimento GO.(A) Istogramma dei punteggi del grado del gene hub.(B) Analisi visiva dei geni hub in CytoHubba.(C–E) Analisi dell'arricchimento GO dei geni hub da tre aspetti: processo biologico (BP), componente cellulare (CC) e funzione molecolare (MF).È stata costruita una rete principale di composti-bersagli-percorsi sulla base dei quattro componenti attivi identificati tramite UHPLC/MS, 15 target hub selezionati dalla rete PPI e otto percorsi determinati dall'analisi KEGG (Figura 5A).Figura 5 Analisi della rete farmacologica.(A) La principale rete composti-bersagli-percorsi.(I diamanti rappresentano i quattro composti attivi; i cerchi rosa rappresentano i bersagli; le frecce rosse rappresentano i percorsi KEGG; i bordi indicano le interazioni tra composti e bersagli.).(B) Sottorete dei quattro composti attivi previsti per essere bersagli di IL6, STAT3, TNF e JAK2 correlati al percorso IL6/STAT3.Abbreviazione: KEGG, Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto.Figura 5 Analisi della rete farmacologica.(A) La principale rete composti-bersagli-percorsi.(I diamanti rappresentano i quattro composti attivi; i cerchi rosa rappresentano i bersagli; le frecce rosse rappresentano i percorsi KEGG; i bordi indicano le interazioni tra composti e bersagli.).(B) Sottorete dei quattro composti attivi previsti per essere bersagli di IL6, STAT3, TNF e JAK2 correlati al percorso IL6/STAT3.Abbreviazione: KEGG, Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto.Per valutare ulteriormente l'associazione tra i principali bersagli e le vie di segnalazione, ci siamo concentrati sulla via infiammatoria IL6/STAT3 per costruire una sottorete che coinvolge IL6, STAT3, Janus chinasi (JAK) 2 e fattore di necrosi tumorale (TNF) (Figura 5B).Nella sottorete correlata a IL6/STAT3, si prevedeva che quattro componenti attivi di SMI (ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re e ophiopogonin D) avessero funzioni interattive dirette con i target principali (IL6, STAT3, TNF e JAK2).Si prevedeva che il ginsenoside Rg1 regolasse IL6 e TNF.Si prevedeva che il ginsenoside Re, il ginsenoside Rb1 e l'ofiopogonina D regolassero STAT3 e VEGFA.Poiché IL6, STAT6, VEGFA e TNF avevano i gradi più alti nell'analisi topologica, abbiamo selezionato questi geni e i loro componenti corrispondenti per valutare la loro attività interattiva mediante docking molecolare.La tabella 4 mostra i punteggi di docking.Valori di affinità di aggancio assoluta maggiori indicavano una maggiore capacità di legame tra i siti attivi dei bersagli e dei composti.La Figura 6 mostra l'aggancio molecolare di IL6 e STAT3 con i quattro componenti attivi.Tabella 4 Affinità di legame tra quattro componenti attivi di SMI e potenziali bersagliFigura 6 Modelli di docking molecolare dei quattro composti attivi che si legano a IL6 e STAT3 (A–D).Tabella 4 Affinità di legame tra quattro componenti attivi di SMI e potenziali bersagliFigura 6 Modelli di docking molecolare dei quattro composti attivi che si legano a IL6 e STAT3 (A–D).Successivamente, abbiamo convalidato gli effetti antinfiammatori dell'SMI sulle cellule 266-6 stimolate con NaT.Qui, 5 mM NaT ha ridotto la vitalità cellulare 266-6 del 60% e SMI (1, 5, 10 e 20 μL/mL) ha aiutato a riguadagnare la vitalità delle cellule 266-6 stimolate con NaT (p <0,05; Figura 7A) .Dalle quattro dosi, 5 µL/mL SMI ha aumentato la vitalità cellulare a circa l'80%.I quattro componenti attivi hanno esercitato effetti diversi sulla vitalità delle cellule 266-6 stimolate con NaT (Figura 7B).Il ginsenoside Re (100, 200 e 400 μM) ha aumentato la vitalità cellulare in modo dose-dipendente, con un effetto massimo a 400 μM.Il ginsenoside Rb1 a 2 e 5 μM e il ginsenoside Rg1 a 50 μM hanno esercitato lo stesso effetto.L'ofiopogonina D non sembrava influenzare la vitalità cellulare 266-6.Figura 7 Effetti di SMI e composti sulla vitalità cellulare e IL6/STAT3.(A) Effetti dell'SMI sulla vitalità delle cellule 266-6 stimolate con NaT.(B) Effetti dei quattro composti attivi sulla vitalità delle cellule 266-6 stimolate con NaT.(C) Immagini rappresentative di Western blotting per p-STAT3, STAT3 IL-6 e β-actina in 266-6 cellule.(D) Livelli di espressione relativa di IL6 e p-STAT3 in ciascun gruppo.I dati sono espressi come media ± errore standard da 4-5 esperimenti indipendenti.**P < 0,01;***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo, #P < 0,05;##P < 0,01;###P < 0,001 rispetto al gruppo NaT.Abbreviazioni: SMI, Shenmai injection;NaT, taurocolato di sodio.Figura 7 Effetti di SMI e composti sulla vitalità cellulare e IL6/STAT3.(A) Effetti dell'SMI sulla vitalità delle cellule 266-6 stimolate con NaT.(B) Effetti dei quattro composti attivi sulla vitalità delle cellule 266-6 stimolate con NaT.(C) Immagini rappresentative di Western blotting per p-STAT3, STAT3 IL-6 e β-actina in 266-6 cellule.(D) Livelli di espressione relativa di IL6 e p-STAT3 in ciascun gruppo.I dati sono espressi come media ± errore standard da 4-5 esperimenti indipendenti.**P < 0,01;***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo, #P < 0,05;##P < 0,01;###P < 0,001 rispetto al gruppo NaT.Abbreviazioni: SMI, Shenmai injection;NaT, taurocolato di sodio.Successivamente abbiamo eseguito saggi Western blot per convalidare l'effetto di SMI sulla via IL6/STAT3 nelle cellule acinose (Figura 7C).La stimolazione con NaT a 1 mM ha sovraregolato notevolmente le espressioni p-STAT3 e IL6 (p <0,01).Prevedibilmente, il trattamento SMI a 10 µL/mL ha ridotto significativamente i livelli di p-STAT3 e IL6 rispetto a quelli del gruppo indotto da AP (p <0,01).La Figura 7D mostra l'analisi quantitativa e il confronto dei relativi livelli di proteine.La Figura 8A mostra le immagini pancreatiche rappresentative colorate con ematossilina ed eosina (H&E).Il 4% di NaT ha indotto con successo i tipici cambiamenti istopatologici associati all'AP che si manifestano come edema diffuso, infiltrazione di neutrofili e necrosi delle cellule acinose, come dimostrato dall'aumento dei punteggi istopatologici (Figura 8B).Il pretrattamento dell'SMI a 10 ml/kg ha attenuato significativamente i punteggi istopatologici dei topi indotti da AP, indicando un effetto protettivo dell'SMI per il trattamento dell'AP.Il 4% di NaT ha indotto con successo la sovraespressione di p-STAT3 e IL6 nei tessuti pancreatici e il pretrattamento SMI di 10 ml/kg ha ridotto p-STAT3 e IL6 (p <0,01) (Figura 8C-D).Figura 8 Effetti della SMI sulla gravità istopatologica dell'AP indotta da NaT nei topi.(A) Immagini rappresentative H&E di sezioni pancreatiche (ingrandimento 100 ×).(B) Punteggi di istopatologia del pancreas.(C) Immagini rappresentative di Western blotting di p-STAT3, STAT3 IL-6 e β-actina del tessuto pancreatico.(D) Livelli di espressione relativa delle proteine ​​corrispondenti.I dati sono espressi come media ± errore standard da due esperimenti indipendenti (n = 3–4 per gruppo).**P < 0,01;***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo, #P < 0,05;##P < 0,01 rispetto al gruppo NaT.Abbreviazioni: SMI, Shenmai injection;NaT, taurocolato di sodio;H&E, ematossilina ed eosina.Figura 8 Effetti della SMI sulla gravità istopatologica dell'AP indotta da NaT nei topi.(A) Immagini rappresentative H&E di sezioni pancreatiche (ingrandimento 100 ×).(B) Punteggi di istopatologia del pancreas.(C) Immagini rappresentative di Western blotting di p-STAT3, STAT3 IL-6 e β-actina del tessuto pancreatico.(D) Livelli di espressione relativa delle proteine ​​corrispondenti.I dati sono espressi come media ± errore standard da due esperimenti indipendenti (n = 3–4 per gruppo).**P < 0,01;***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo, #P < 0,05;##P < 0,01 rispetto al gruppo NaT.Abbreviazioni: SMI, Shenmai injection;NaT, taurocolato di sodio;H&E, ematossilina ed eosina.AP è una malattia digestiva comune senza interventi clinici specifici.La MTC consente di trattare l'AP in modo efficace e sicuro nella pratica clinica.Poiché il "calore malvagio" è stato ampiamente accettato nella MTC come la causa principale di AP, i principi di "eliminazione del calore, rimozione delle tossine e purificazione" dovrebbero essere seguiti e sono stati studiati.La progressione della tossina da calore può potenzialmente danneggiare il Qi e lo Yin e il trattamento di "pulizia e purificazione" può causare o aggravare la carenza di Qi e Yin.Sulla base di questa patogenesi, abbiamo proposto che il nutrimento di Qi e Yin dovrebbe essere un'importante terapia aggiuntiva nelle prime fasi di AP.Tuttavia, pochi studi si sono concentrati su questo problema.L'SMI, estratto da Panax ginseng e Ophiopogon japonicus, è un estratto usato frequentemente per il deficit di qi-yin.22,23 In uno studio precedente con un modello di ratto grave indotto da AP, la somministrazione di SMI ha ridotto gli indici infiammatori, attenuato la gravità istopatologica di organi e segnalazione HO-1 attivata.29 Nel presente studio, per la prima volta abbiamo eseguito una strategia integrata di determinazione del principio attivo, farmacologia di rete, docking molecolare e validazione sperimentale per studiare le basi chimiche ei meccanismi dell'SMI.Nel nostro studio, lo screening dei componenti ha inizialmente rivelato 72 composti attivi di Panax ginseng e 47 composti di Ophiopogon japonicus, dai quali abbiamo ulteriormente determinato i componenti attivi.Successivamente, l'analisi UHPLC-QTOF-MS ha verificato quattro componenti attivi dell'SMI (ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re e ophiopogonin D), che era coerente con i rapporti precedenti.26,27 Il nostro esperimento ha dimostrato che ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1 e ginsenoside Re efficacemente alleviato il danno cellulare acinoso pancreatico.L'ofiopogonina D sembrava non esercitare alcun effetto protettivo sulla riduzione del danno nelle cellule 266-6 in coltura.Tuttavia, non abbiamo rilevato il rapporto e il dosaggio dei quattro principi attivi nell'iniezione di Shenmai, quindi non è stato possibile ottenere l'efficace dose protettiva dei principi attivi.Sono necessari ulteriori studi per lo sviluppo di trattamenti farmacologici basati su SMI per AP.Utilizzando l'analisi topologica e la sottorete farmacologica, abbiamo scoperto che quattro componenti attivi di SMI (ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re e ophiopogonin D) avrebbero funzioni interattive dirette con IL6/STAT3.Inoltre, un approccio di docking molecolare dettagliato ha rivelato che questi componenti attivi mostravano una buona affinità per IL6 e STAT3.I nostri studi sperimentali hanno dimostrato che l'SMI ha aumentato la vitalità delle cellule acinose pancreatiche del topo stimolate con NaT e ha alleviato i cambiamenti istopatologici del pancreas nei topi AP indotti da NaT.Inoltre, SMI ha ridotto le espressioni di IL6 e STAT3 sia in vivo che in vitro.IL6, una citochina proinfiammatoria, è significativamente aumentata e correlata positivamente con la gravità dell'AP.30-32 L'IL6 circolante si lega a IL6Rα e gp130 sulle cellule bersaglio o si lega a una forma solubile di IL6Rα (sIL6R) per formare un complesso che interagisce con la membrana legata gp130, attivando così JAK a valle e STAT3 fosforilando la tirosina 705.33 Quindi STAT3 si dimerizza e si trasloca nel nucleo per regolare i suoi geni bersaglio.Questo ciclo di feedback positivo amplifica la progressione della cascata infiammatoria sistemica durante AP.34 L'anticorpo neutralizzante contro IL6 ha efficacemente inibito l'attivazione di STAT3 nel pancreas e ha ridotto la gravità della malattia promuovendo l'apoptosi delle cellule acinose del pancreas.35 Studi hanno dimostrato che l'SMI ha effetti immunomodulatori contro lesioni infiammatorie mediante la soppressione dei mediatori.25,36 I ginsenosidi sono una classe di glicosidi steroidei e saponine triterpeniche, che comprende oltre 40 membri.Oxid Med Cell Longev.J Biol Chem.JClin Invest.Oxid Med Cell Longev.Tutti i diritti riservati.